μMACS™ One-step T7 Template Kit
oligo(dT)-磁気ビーズで直鎖 T7-cDNA 合成： バイオプシーや少ない細胞数などの限られた検体から、T7 cDNA テンプレートの合成を容易に行える、画期的方法です。 カラム内 cDNA template 合成：カラム内で cDNAテンプレートを合成し RNA転写を行うので、ピペッティングの反復を減らし、サンプルのロスを最小限に抑えます。 再現性のある antisense RNA (aRNA) の転写：操作の簡単な MACS® Technology とすぐに使える調製済み試薬により、実験者によるバラつき、処理時間、そしてテンプレート調製のバラつきを抑えられます。 マイクロアレイ解析のスピードアップ：μMACS™ One-step T7 Template Kit により、細胞や組織検体から、カラム内で T7プロモータを含む2本鎖cDNAを合成するまで、140分で完了します。次に行う in vitro 転写 (IVT) もそのまま同じカラム内で行えます。そのため、サンプルのロスを最小限に抑え、マイクロアレイ解析に使用する aRNAを効率よく転写することが可能です。(μMACS One-step T7 Template Kit には、IVT を行うための試薬は含まれておりませんので、ご注意ください。). MACS Technologyを使えば、最少5×10 4 細胞またはtotal RNA 250 ng程度の生物材料から信頼できる遺伝子発現解析が可能です。一般には、普通のマイクロアレイ解析に十分量の aRNA を1000倍まで増幅されます。例えば、total RNA 250 ngからはaRNA 約2–4 μg 、total RNA 1 μg からはaRNA 約10–20 μg ほどの収量があります。 T7-cDNA template 合成におけるMACS® Technology：まず、Oligo(dT)プライマー-を結合させた極小の磁気マイクロビーズ を細胞ライセートに添加します。thermoMACS™ Separator の加温調節できる磁石にセットしたμ Column に、このライセートをアプライすると、 MicroBead-mRNA 複合体が強い磁場に保持されます。数回の洗浄ステップの後、すぐに使用できる逆転写酵素反応液をカラムに加えて、42 ℃で 1st cDNA を合成します。次の 2nd cDNA合成反応液には、DNA ポリメラーゼ、リガーゼ そして RNase H が含まれており、2本鎖 (ds) cDNA を生成します。 この ds cDNA を精製した後は、そのまま同じカラム上で T7 RNA ポリメラーゼを用いて3時間で IVT 反応を行うことが可能です (μMACS One-step T7 Template Kit には、この酵素は含まれていません) 。この場合、増幅された RNA を溶出し、精製すれば、PIQOR™ Microarrays, antisenseキットなどのラベリングやマイクロアレイハイブリダイゼーション実験に供することができます。 カラム内での効率的な合成： 迅速で簡便な μMACS の操作により、RNA のコンタミネーションや分解の危険性を減らすことができます。さらに、一般に別のチューブへサンプルを移す際や、沈殿操作、洗浄ステップのたびに起こるサンプルのロスを、カラム内反応により最小限に抑えることができます。これは、サンプルの量が少ない場合には特に重要となります。μMACS One-step T7 Template Kit とそれに含まれる高活性の逆転写酵素は、カラム内での aRNA 増幅に使用できる完全長cDNA を生成できるようにデザインされています。μMACS One-step T7 Template Kit を用いたカラム内 aRNA 増幅の原理は、figure 1 をご覧下さい。 Columns μ Columns (キットに含まれる) Further information RNA research brochure [PDF; 2,4 MB] Average RNA yields [PDF; 66 KB]		Figure 1 Principle of μMACS One-step T7 Template Kit Figure 2 Amplification of two identical mouse liver samples Two identical mouse liver tissues individually amplified with the μMACS One-step T7 Template Kit in combination with the Microarray RNA Target Synthesis Kit (T7), Roche Diagnostic GmbH. Samples were labeled with Cy3 and Cy5 fluorescent dyes, respectively. 500 ng of each labeled aRNA were hybridized to PIQOR Immunology Microarray, mouse, antisense (1,076 genes). The resulting regression coefficient is 0.99. Figure 3 Comparison of traditional versus μMACS T7 RNA amplification T7 amplification products were generated from 1 μg of mouse liver total RNA, reverse transcribed, and analyzed. Electropherogram of amplified RNA from the standard protocol in tubes is shown in purple and from the in-column procedure with μMACS Technology in black (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies Inc).

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